显微镜数字化成像技术在临床检验医学中的应用

  当机器假阴性率比人工高时，机器的作用就有限，这就是当前骨髓形态机器的困境。

  上世纪七十年代前，库尔特阻抗法计数细胞还未发明时，血细胞的分类计数都在显微镜下完成。人工形态学分类计数虽然效率低下，重复性差，但它至今依旧是血细胞分类计数的金标准。

  抗干扰能力强，EDTA抗凝引起的血小板聚集后计数不准的问题，在形态学方法下可以排除；

  准确性更高，单核细胞与淋巴细胞在瑞氏染色时更容易区分；可计数更多的细胞种类并确认异常细胞；

  使用自动化设备实现基于形态学法（金标准方法）的血细胞分类计数无疑是血细胞仪最终的发展趋势。在这个方向上有不少公司做了尝试并在逐渐实现中。

  Cellavision是目前使用最广泛的外周血血细胞形态学自动化分类的仪器，位于瑞士的Cellavision公司生产的DM96, DM1200,和DM9600阅片机通常与Sysmex、Beckman Coulter公司的血球流水线联合。触发复检规则的样本进入推片、染色流程后，外周血涂片由阅片机完成100个白细胞的分类计数及相应视野内红细胞的形态学分类。形态学阅片机整合到血球流水线后，血细胞分类计数基本完成了全自动闭环，所有环节都实现了自动化，检验医师只负责对检测结果进行审核。

  目前五分类血球仪的检测速度平均为100标本/小时，按15%比例复检，每小时约有15张玻片会输送到Cellavision阅片机上。阅片机采集100个白细胞做分类计数，平均每张玻片的分析时间为2分钟，其中中性分叶核粒细胞的分类准确性为92.5%，淋巴细胞为96.4%，单核细胞为81.4%，但对于一些含量低的细胞类型，如幼稚细胞，浆细胞，嗜酸性、嗜碱性粒细胞，检测细胞数量太少易导致漏检或结果不准确，文献同时报道通过增加阅片检测细胞的数量，稀有细胞的检出率灵敏度会提高，综合下来一台阅片机的工作效率接近于一名形态学专家［13］。

  Cellavision阅片机的工作流程为先使用10x镜扫描样本，找到体尾交界可阅区内的白细胞，进而选择其中的100个白细胞，并使用100x油镜对其依次拍照和分类计数。在实践中，单台阅片机的速度虽然与一个形态学专家相当，但对异常样本的分析能力不够。对于大样本量的机构需要几台设备才能匹配血球仪的速度，更重要的是，由于机器阅片采样数量少而无法排除假阴性（形态学复片的目的），人工阅片仍不可被取代。

  罗氏公司在2012年以2.2亿美金收购了Bloodhund公司的一体化图像法血细胞分析仪，并于2017年获得FDA批准用于血细胞分类计数。Bloodhund技术最大的创新点是血细胞喷涂技术，血膜的形成不是传统的推片法，而是由一根细针将血细胞均匀地喷在玻片上。这种方式下制成的血涂片，细胞分布均匀，没有传统推片后的体尾交界处，各类型细胞均匀分布，没有海岸线效应。更重要的是制片实现了定量血推片，即玻片上的血样体积是固定且样本均匀分布，能够较好地避免采样误差。

  cobas m 511血细胞计数图像法一体机检测结果与人工镜检总体符合度为95.7%，对异常细胞检测灵敏度与特异性分别是95.9%与74.6%，与Sysmex XN结果相关性R ≥ 0.95。图10显示，通过图像法运算得到各参数结果与血球仪检测结果几乎一致［15］。

  cobas m 511的各项参数与传统血球仪相当，但其售价在30万美金以上，每小时可检测60个样本，虽然结果可以一步到位，没有再次人工复检的要求，但相对于十分之一售价的五分类血球仪，其性价比明显不足。2018年上市后反响平平，目前已经停止销售。

  推出Vision Hema血细胞形态阅片机的West Medica公司位于奥地利，是一家专注于显微成像与分析的公司，该企业具有完整的基于普通显微镜基础的扫描系统，以及丰富的基于AI算法的分析软件 （包括：外周血涂片血细胞分类计数，骨髓细胞分类计数、微生物分类计数软件、形态分析等） 。另一家EasyCell公司的阅片机EasyCell Assistant整体工作流程与Cellavision相同，可以计数100~200个白细胞，准确率相当。此外在过去10年中，国内有多家公司仿制了Cellavision系统，性能与之类似，但目前都已从市场上退出。

  Bionovation产品设计理念：Cellavision及类似产品 （最高峰时有5家以上） 作为血涂片阅片机尝试替代人工阅片，但实际应用中缺乏实用性，如果不依附血球厂家流水线的打包销售，作为独立产品时，难有生存机会。原因如下：

  由于这两点原因，人工阅片无法被完全取代，机器的价值十分有限。对于血涂片，人工阅片的流程为：先低倍镜整体观察全部样本，搜索各种异常可能，如：异常细胞、寄生虫；若发现异常则使用100x油镜观察描述，无异常则选择体尾交界处的100个白细胞作分类计数。基于100个白细胞的报告只对含量超过10%以上的群体可靠，计数含量在1%以下的细胞群体时，细胞计数数量要增加到1000个以上。 流式法的血球仪数据可靠性高的基础是细胞检验测试数量大，通常白细胞计数超过5000个，这个特性就如同人工全片搜索异常一样，排除了假阴性的存在。在排除假阴性情况下，计数10个、100个或1000个细胞时，只是报告精度不同，不影响样本的定性 （正常或异常） 。

  机器检测结果由形态学专家复核，假阴性概率低，且形态学专家无需再回到显微镜镜下观察样本。

  血球仪能成功替代大部分人工镜检也是相同原因：•计数5000个以上细胞； •每小时60个样本以上；

  在复检规则下，几乎无假阴性。如果人工镜检做同样事情时，综合效率会慢百倍以上。

  通常情况下，血涂片推片的血量在1~2μl左右，正常样本时全片的白细胞数量在4000~20000个。中位值在8000左右，由于形态学检测的特点，单个目标物即可确认，阳性检出率可认为是单个目标物/μl，这个检测灵敏度是其他方法学不能够比拟的。

  1024维特征提取后降维到2维后，五分类白细胞的散点图 Bionovation的形态学工作站使用2台IMX250芯片相机时，可在2分钟内完成整张玻片的100x油镜数字化扫描，自动涂片机可使用1~5μl血样制成全单层血片，染色后全片扫描。对于外周血样本，扫描进行时，AI会实时搜索疟原虫感染 （其他寄生虫感染视需要可以执行） 、细菌、分类计数白细胞、血小板及红细胞形态。由于是全片扫描，全片所有细胞都会被分类计数并提示异常，报告时可以指定只计数体尾交界处细胞 （100~100百万个细胞） 。图11为AI计数五分类细胞的2维特征散点图。

  尿沉渣检查的自动化分析：检验科的三大常规之一：尿沉渣检测，由于其原始样本需要富集，且成份复杂、多样性高，全自动化的历程坎坷，各种方案使用下来都有不足之处。

  由于尿液样本有形成分浓度不一，金标准方法要求使用浓缩尿提高检测灵敏度过程如下：尿液10 ml离心5 min，相对离心力(RCF)为400，弃上清，留沉渣尿量0.2 ml混匀，吸取20 μl，滴在玻片上用18 mm×18 mm盖片覆盖，先用10×10低倍镜观察全片，再用10×40高倍镜仔仔细细地观察，检查细胞至少10个视野，检查管型至少20个低倍视野，报告以高倍视野所见最低至最高数字表示。如果在滴片前使用SM染色或S染色，各有形成份在镜下更易观察。

  数字化流式形态学检测：利用缓冲等张液iQ鞘液的水动力聚集功能及流式细胞计数池的层压进行仔细的检测。可实现有形成分以尽量平铺不重叠的方式，最大剖面朝向显微镜镜头进行图像捕捉。自动粒子识别 （APR） 功能对图像中的有形成分进行分隔、特征分析及自动分类。

  （图12） ： 可直接通过屏幕结果界面进行仔细的检测结果的复查，缩短样本周转时间。

  Iris尿仪与其他形态学法设备原理类似，原始尿被泵入一定高度空腔流动室内，使用10x、20x物镜 （低NA，高景深） 拍摄尿液。空腔芯片有两种方式：流动型和固定体积型。流动型空腔芯片，尿液在其中连续流动，单次检测尿量可以连续设定，时间越长样本抽样体积越大，灵敏度越高。固定体积型为单次灌注一定体积（100μl~200μl）尿量后，待有形成份沉降到芯片底部拍照。

  原始尿液直接形态学检测的最大挑战是如何避免假阴性。大体积的管型或团块物容易沉底，导致小样本量原始样本取样时容易遗漏。流动中拍照或沉底拍照都存在样本漂浮翻动成像效果不理想的风险。该类型的尿沉渣仪器检测到阳性目标物后，常常要用户再次按照金标准方法重新制作后镜下复片确认。

  Sysmex UF流式法尿沉渣仪介绍：流式细胞仪方法检验测试液体中的粒子是一个高效工具，Sysmex公司的血球计数技术同样可用于尿液内有型成份的分类计数。使用荧光染色与不同角度散射光，可以区分白细胞、红细胞、管型、结晶与细菌。因为该仪器还是初筛设备，任何阳性样本，都需要用户将尿液离心制片后镜检。

  Bionovation产品介绍：Bionovation扫描仪使用60X NA1.25油镜，采样分辨率为0.17μm/像素，可全片扫描SM染色后的尿沉渣玻片，扫描时间在60秒内。样本中1μm以下的杆菌、球菌等成分均清晰可见。经SM染色后，尿液标本有形成分原有状态得以保存，且对管型、上皮细胞等成分鉴别有明显优势。通过ResNet50网络训练，可完成自动分类各尿液有形成分。 （图12-图15）

  使用浓缩尿制片观察的最大好处是可以最大可能地排除假阴性，但是连续的大样本量尿常规检验测试，每个都需要5分钟的离心浓缩后阅片，工作量巨大。Bionovation正在开发更快的样本富集方法，使一个尿常规按标准浓缩法制片后全片扫描、结果输出总时间控制在一分钟以内。

  胸腹水脱落细胞学检查：胸腹水样本虽然数量不多，但多涉及有明显症状的传染病或肿瘤诊断。如果送检目的是检查有没有结核杆菌或寄生虫感染，通常是临床检验的范畴；但如果送检目的是确认是不是真的存在肿瘤细胞，则是细胞病理的范畴。同一份样本可能会送检至不同部门，但由于样本抽样问题，检验人员看到了肿瘤细胞、病理人员看到了寄生虫或细菌。

  如果样本玻片数字化后同时发送两个部门阅片，会在某些特定的程度改善这个情况。胸腹水及其他体液样本的多样性：送检胸腹水或其他体液样本时，多是为了查明病因。从感染到肿瘤，引发疾病的原因多样化，所以体液样本阅片时要求形态学专家必须经验比较丰富，不漏检各种可能性。

  体液样本中的细胞浓度不同于血液，前者浓度范围跨度大，如肉眼可见清澈透明的样本中细胞量少，需富集后制片；而血性样本需要稀释后制片。另外，采集样本的体积差异大，有多到几百毫升的腹水，也有少至几十微升的脑脊液。液基薄层细胞制片技术对于标准化体液样本制作是个理想选择，制片的方法有：①膜过滤法；②离心沉降法；③自然沉降法等。使用标准化的商业仪器制片，可以明显提升制片质量，并能定量样本制片，方便计算细胞绝对浓度。缺点是检测成本上升，检验科形态学检查一般收费较低，广泛采用有一定难度。

  Bionovation盲扫技术及细胞自发荧光检测：体液样本中细胞数量过少 （如脑脊液） 是阅片的一个难点，即便只有几个细胞，也无法排除其阳性可能 （有诊断价值） 。

  镜下搜索往往是形态学专家最花费时间的环节，搜索到异常细胞或有形成份是做出正确诊断的基础，当无法判断属性时，可以求助远程会诊。 样本有形成份过少不仅会使人工阅片时间延长，也会导致大部分显微扫描仪无法工作，因为扫描时需要聚焦样本，当样本中没有物质提供Z轴聚焦高度时，扫描就没办法完成。若使用Bionovation聚焦玻片与算法，可以克服这个问题。

  11骨髓涂片AI的应用方向：机器学习最适合于单个目标的识别与分类，在工业生产里被大范围的应用，如宏观领域的电路板缺陷检验测试，微观的晶圆缺陷检验测试 （工业显微镜） 。机器视觉 （包括深度学习） 在方法、流程上都已经相对成熟，但骨髓细胞分类却鲜有使用自动化机器的。即使Cellavision在外周血、体液检查中应用多年，目前也没有拓展到骨髓细胞分类上。

  制片无法标准化，骨髓穿刺样本多为不抗凝样本，样本采样量小，抽取后直接推片。推片质量差异大，样本厚度高，通常含有骨髓小粒。

  染色试剂及染色方法实验室已形成多年习惯并对应一定的阅片习惯，不容易改变或达到室间一致。

  细胞分类数量众多，细胞类型为连续过渡，种类之间相互叠加，不满足机器学习分类要求：即类别差异明显要求。

  人工阅片时需要全片搜索可能的异常细胞，不像血常规玻片给出100~200个细胞分类计数即可。

  玻片数字化时，个人对色彩的感觉不同，不同形态学专家之间对样本细胞颜色设置不统一，AI训练模型大范围内使用有困难。

  当机器假阴性率比人工高时，机器的作用就有限，这就是当前骨髓形态机器的困境。目前市场上的骨髓细胞阅片机的设计思路同外血周涂片机器类似，在骨髓涂片的任意单层区选取200个细胞报告，但忽略了骨髓阅片时的最关键的步骤：全片搜索并描述可见异常 （99%工作内容） ，而是更关注选取典型区域 （0.9%工作重要性） 、分类计数200个细胞 （机械重复工作） 等相对不重要的内容。

  [13]CNN（卷积神经网络）最早是哪一年提出，是怎么样发展的？- 知乎

  原文以《显微镜数字化成像技术在临床检验医学中的应用》为题发表在《临床实验室》杂志2022年6月刊专题“血液系统疾病实验室诊断”专家论坛版块

  本文由“健康号”用户上传、授权发布，以上内容（含文字、图片、视频）不代表健康界立场。“健康号”系信息发布平台，仅提供信息存储服务，如有转载、侵权等任意的毛病，请联系健康界（）处理。

  显微镜,数字化,形态学,阅片机,白细胞,血球仪,血涂片,医学,检验,临床,技术,样本,计数,玻片,检测,尿液